细胞培养法在细胞生物学上的贡献很大

新闻来源:未知 发布时间:2011-11-5 22:53:22

细胞系的建立及其应用

【摘要】我们不可能直接以人体去测试一些外界因子(如辐射、化学、药物等)对人体的效应,细胞系是很好的工具,它可以给我们很多讯息。

人是个生物个体,可是我们很难想像人是由上亿的细胞和它的衍生物所「黏」成的;而且无法以肉眼观察的细胞,对我们说来更觉得抽象。由于细胞是个体所组成的最小单位,因此细胞所产生的不正常变化将是个体变异的先兆。所以,将细胞培养在人为控制的环境下,可间接探测外界因素对个体的影响。从本世纪初起,「细胞培养技术」(cell culture technic)在生物实验室中就一直扮演很重要的角色。细胞培养最大的利益是,「细胞的分裂」能在我们控制的环境下进行,更可以广泛应用。

目前已经有四百多种细胞成功地从「活体内」(in vivo)转移到「活体外」(in vitro)培养而建立成细胞系(cell line)。这些细胞系有初级细胞系、延续细胞系及有限生命细胞系三大类。在培养方面,依细胞特性和实验目的已经发展成三种细胞培养方式:单层培养(monolayer culture)、悬浮培养(suspension culture)、超小粒固定化培养(superbead microcarries culture)等。目前在生物实验中,有关细胞系建立的技术都已相当成熟,而建立细胞实验室进行细胞生物学的研究,是从事基础医学最重要的奠基工作。


细胞与生物个体的关係

生物个体的形成,不论是动物或植物,都是由上亿的细胞所组成,起初是由一个单细胞──受精卵,循着一定的生理规律分裂生长。细胞是有生命的,且带有特定遗传质体(specific genetic plasma),由前一代传到下一代。

利用显微镜可将个体内上亿的细胞分辨出许多种不同的类型。个体的发育必须经过两个大步骤:第一,由受精卵增殖分裂产生大量的细胞,此过程中需发生数百万次的分裂;第二,细胞生长繁殖到某阶段时,必须在各不同部位,精确分化成不同功能的细胞,再以非常有秩序的方式结合起来,而特化成各种组织与器官,进而形成个体。

个体的一切表现必须受细胞中遗传质体的支配,一旦细胞受损,在严重的情况下,细胞会死亡,轻者,细胞会起不正常的变化,进而影响其他的细胞、组织或器官,甚至整个个体。

活体外细胞系的建立

因不同的研究目的,将所需要的组织或器官从生物个体内取出,放在培养皿内(见图一);以生理食盐水(0.9% NaCl)冲洗,将一些不必要的组织去除乾淨,用剪刀或手术刀将剩馀所要的组织切成1立方毫米大小的碎片,再以生理食盐水冲洗;然后把小碎片组织放到含有胰蛋白(trypsin)溶液的培养瓶内,在适当的温室内振动30分钟。胰蛋白能使细胞从组织上脱落而个别分开,接着将这些已分开的细胞製成细胞悬浮液,再由细胞悬浮液中取一些细胞接种于培养基内,置于37℃的恒温箱(incubator)中培养。培养基内的细胞会附着在培养皿的表面,并生长、分裂、繁殖。

如此能在培养皿中繁殖的细胞,称为细胞系。由于细胞本身的代谢物不断积存,而培养基内的营养物质也逐渐用尽,所以每隔一段时间必须将细胞从旧的培养培基内移植到另一新的培养基内,一般都是每隔三天转移一次。依细胞的特质,有些细胞在有限次(小于70次)的移转培养时就老化死亡,此谓有限生命细胞系。超过70次或无限次的移转而能在实验室中繁殖的称为延续细胞系。

细胞培养方法

生物实验室中常用的培养方法依其目的和特性可分三大类:器官培养(organ culture)、组织培养(tissue culture)、及细胞培养。其中以细胞培养最为困难,因为一般都以高等动物为研究的对象,其细胞都已高度特化,独立性很弱,欲使其独立生存繁殖,必须周详考虑其生活所需之环境因子。

培养细胞的方法一直是细胞生物学家探讨的;若是个体所有部位的细胞都能在体外培养成功,对生物研究,医学诊断与治疗将是一大突破。目前自动物体内培养成的延续细胞系的数目如表一。依细胞的特性和实验目的之需要而有不同的培养方式(见表二)。

一个新的细胞系必须经过一些例行的分析步骤,确认为稳定后,才能应用到实验之测试,图二表示其例行工作。从引进新细胞以后,首先要大量繁殖,以稳定「量」的来源(1);再将其中部分细胞冰冻在液态氮内,视必要时再解冻成新的来源(2)。

量的来源稳定后,当求质的纯化,使我们实验用的细胞族群能为同一祖先细胞衍生而来。在表面积25平方公分的培养皿上,种植100个细胞,必须使其成为单细胞培养,经过7天左右的培养,每一单细胞会长成一群落(colony),而且此群落是由同一祖先细胞衍生而来的,以达到纯化目的,此谓次营养系培养〔subclone,(3)〕。选取几个生长良好的群落,做核型分析〔karyotype test,(4)〕,计算在100个细胞内每一种染色体数目所占的比例多少,用以说明实验所用的细胞族群是基于何种比例的染色体数。量的稳定及质的确定后,就行一般例行培养(5),每三天移转一次,期使细胞保持在最佳的生长状况,以备实验需要。在实验测试之前,必须先做种植率分析〔plating efficiency test,(6)〕:一般理论,种值100个细胞,应该长成100个群落,但由于外界因素及细胞本身状况,实际上收穫不到100个群落;而所收穫的群落数占种植细胞数的比率即为该细胞族群的种植率,以校正细胞的自然死亡。

实验测试后,细胞必须丢弃,下次实验所需细胞的数量超过例行培养数,则必须重新解冻,再进行另一次的例行培养工作。


细胞系的应用

细胞培养法在细胞生物学上的贡献很大,随着细胞培养法的进步,一些新设立的基础医学研究部门也相对的发展起来。细胞週期分析法、同步培养法等的改进,也同时对于该方面知识的发展有很大的助益。

利用细胞融合和杂种形成的技术,把来自人类的淋巴细胞和小白鼠的细胞融合成为一个新的细胞,而使其不断的增殖。製作染色体舆图(chromosome map),解析遗传因子呈现的机制及融合瘤(hybridoma)的形成。体细胞遗传学(somatogenetics)、细胞工程学(cytoengineering)上,均可以细胞培养来作为研究的工具。另外原先认为无法再行分裂的小淋巴球,经过培养的结果却发现,小淋巴球再受到各种刺激后仍可旺盛地分裂下去。此种淋巴球培养技术,除了在免疫学上以外,对于人类遗传性疾病的了解也有很重要的应用。在病毒学的研究上,必须将寄主细胞控制于最单纯的情形下进行细胞培养,而细胞系的培养技术近年来使得病毒在分子生物学上的研究,有着不可磨灭的贡献。

人类历史上早已有毒性物质。近代人类文明进步后,製造许多化学物质及辐射线,对生物可能引起不良的影响,为了这方面的研究,细胞培养法提供了调查毒性时所需的简便筛选法(screening),或作为探讨毒性的机制。因此,它对于病毒学的研究是很重要的。

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