---
---
---(点击查看产品报价)
本文标题："初代细胞培养方法与步骤（猪肺）"
初代细胞培养方法与步骤（猪肺）
(一) 初代细胞培养 (猪肺泡巨噬细胞)
1. 4-8週龄SPF猪以适量之citosol经耳静脉注射麻醉后，予以放血，剖检取出肺
脏 ， 将 气 管 由 下 方 1/3处 剪 断 后 ， 以 pH 7.4， 含 0.2% EDTA无 钙 镁 之
Dulbecco's PBS (D-PBS) 沿气管灌入，每次50-100 ml，经施以数次轻柔按摩
后，再倒入覆有纱布并经silicon处理过之灭菌好的烧杯裡。如此重覆5-7次，
至灌入的总量达500 ml为止，如此约可收肺冲洗液70-80%左右。
2. 将肺冲洗液离心，500 xg，4℃，10分钟，打下细胞后，再加入适量 PBS
清洗，如此重複清洗三次。
3. 最后一次加入适量含10% 经非动化胎牛血清(FBS)，100 unit/ml penicillin
及100 µg/ml streptomycin之RPMI-1640细胞培养液中。
4. 以0.1% Trypan blue染色，并于显微镜下计算细胞存活率，将存活细胞调成
2×106 cells/ml 浓度。
5. 将此浓度细胞，培养于24孔平板培养皿中(1 ml/孔)，和4孔 chamber slide中
(0.8 ml/孔)，37℃，5% CO2培养2小时。
6. 以PBS清洗二次，换入等量新鲜细胞培养液，置入37℃，5% CO2培养5小时，
备用。
(二) 初代细胞培养 (鸡胚胎纤维母细胞；chicken embryo fibroblast cell; CEF)
1. 选用9-11日龄鸡胚，以酒精、碘酒消毒后，利用镊子钝端敲破蛋壳，再用
另一无菌之镊子夹住鸡胚颈部，使与卵黄囊剥离，取出鸡胚。
2. 剪除头、四肢及内脏，并将馀胚剪碎后置于消化瓶中。
3. 以每胚加3 ml PBS搅拌，去除上清液，重複清洗2～3次，直到PBS清澈无红
血球为止，去除PBS。
4. 加入40至50 ml之0.05% Trypsin/EDTA消化液，搅拌5分钟。
5. 以两层灭菌纱布过滤上清液，倒入置于冰上之离心管中（内含3-5 ml 10%
非动化FBS）
。
6. 重複消化及过滤步骤3-4次（纱布需每次更换）
。
7. 以1000 rpm、10分钟离心后，去除上清液。
8. 加入含10% 非动化FBS之MEM细胞培养液后，再次离心，去除上清液。
9. 于显微镜下计算细胞存活率，将细胞调成4×106 cells/ml 浓度。
10. 将此浓度细胞，培养于25 cm2培养瓶，37 ℃，5% CO2培养，备用。