初级细胞的初代培养-显微镜下观察神经细胞的型态

新闻来源:未知 发布时间:2011-11-9 11:01:22

湿度固定、空气成分含百分之五之二氧化碳(5%CO2/95%

Air)培养箱。每两天替换新鲜10%FBS之DMEM/F12,培养细胞至第九天进行实验。

二、初级细胞的初代培养(Primarymixglialculture)

以麻醉剂pentobarbital将出生1天之鼠牺牲后,将其大脑

皮质组织置于内含penicillin-streptomycine、fungizone及

HBSS配置成的solutionD中,清除血管与残馀软脑膜后以机

械方式绞碎。将脑组织浸泡在细胞培养液及0.25%胰蛋白脢

消化液(Trypsin-EDTA)中,在37℃水浴槽静置5分钟待细

胞沉淀,去除上清液,加入含有10%FBS(FetalBovineSerum)

DMEMF-12培养液,离心(2000rpm)10分钟。去除上清液,

加入新的细胞培养液并以电动吸管(Pipet)反覆吸放数次,

溷合均匀,以纱布过滤不要的组织块。细胞悬浮液以血球计

数器计算细胞数,再分种于预先舖有poly-L-lysine(0.02g/L)


处理过的12孔细胞培养皿内(细胞数约为5×105cells/well)

细胞培养于37℃、湿度固定、空气成分含百分之五之二氧化

碳(5%CO2/95%Air)培养箱。每两天更换10%FBS之

DMEM/F12之培养液,培养9-12天取用细胞进行实验。

贰、细胞免疫染色(Immunocytochemicalstaining)

透过细胞免疫化学染色法分别鑑定培养之神经细胞与溷

合胶质细胞,以glialfibrillaryacidicprotein(GFAP)之抗体

标示星状胶质细胞,以微小管相关蛋白质-2(microtubule

associatedprotein-2,MAP-2)之抗体标示神经细胞,以OX-42

之抗体标示小神经胶细胞。药物实验后,给予4%福马林固定

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二十分钟,先将样本以PBS清洗二次,目的为洗去固定液,

以0.4%TritonX-100与1%BSA溷和溶入PBS製成的Blocking

soluyion处理30分钟,以PBS清洗后分别加入所需之一级抗

体(primaryantibody),包括

anti-MAP-2,存放于4℃反应24小时后以PBS清洗一次,使

用二级抗体(biotinylated

immunoglobulins)反应2小时以PBS清洗一次,加入ABC

solution反应30分钟,以PBS清洗一次以DAB加5%H2O2

进行呈色反应,并于显微镜下观察神经细胞的型态。

anti-GFAP、anti-OX-42、

anti-rabbit

and

anti-mouse

参、细胞伤亡测试

一、定性:

(1)藉由显微镜观察细胞型态的变化,了解细胞受损的情

况。

(2)

A.原理:

Trypanblue会直接进入死细胞中而呈色,而活细胞膜完

整且具有选择性通透性,染料无法渗入而不会呈色,由此

可得知细胞存活率,此法又称色素排除法。

Trypanblue染色法:

B.步骤:

trypanblue(0.4%)与细胞培养液以1:1比例充分溷合,

1ml/well加入培养皿,静置30分钟后以PBS清洗至乾

淨,显微镜检查其染色状况。

二、定量:

MTTassay:

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A.原理:

药物处理过的细胞,其存活率(cellviability)可以MTT

还原法评估。健康细胞可产生较多之能量供细胞代谢粒腺

体内的琥珀酸去氢酶(succinatedehydrogenase)能将MTT

3,(4,5-dimethyl-thiazol-2-yl)

bromide)由黄色还原为紫色之formazan结晶颗粒,而还原

力的强弱,即可代表琥珀酸去氢酶之活性,也就是代表代

表细胞之生理状况以及存活率(Manthorpeetal.,1986)

2,5-diphenyl-tetrzolium

B.步骤:

药物实验后,将溶入0.1MPBS之MTT(5mg/ml)经

0.22µmfilter过滤,以1:9之比例加入细胞培养液,置

于培养箱中约

Isopropanol1000µl/well并反覆冲洗以便将结晶之MTT

完全溶解,取其溶解后之液体置入分光光度计中

(SHIMADZU,UV-1601,Japan)以波长570nm测定

MTT反应的量。

另将培养皿置于倒立显微镜下观察型态,藉由观察细胞

型态的变化,瞭解细胞受损的情形。正常健康的神经元细

胞会呈现平滑之椭圆或圆的外型及直径一致,外型平滑的

轴突。死亡的细胞外观呈现细胞膜不完整,细胞萎缩、破

裂以及轴突断裂的现象。

1小时后,将上层液体吸除,加入

第三节、资料之统计与分析

将实际测得之数值平均后,以平均值加减标准误(Mean

±SE)为製作图表之依据。并使用SigmaPlot套装软体,进行

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重複变数单因子变异数分析(One-wayANOVA)来分析各组

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