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本文标题："基因植入动物细胞最常用的方法?"
基因植入动物细胞技术
此处紧介绍最常用的方法, 并以组织培养之单层细胞为标的.
组织培养动物细胞, 应注意无菌技术, 为求初学者溶液着手, 以Hela细胞, 即可高温高压消毒的MEM培养液开始, 加入10﹪的牛血清. 并加入Gentamicin sulfate(抗生素), 以防污染. 在细胞剥离培养器时, 採用0.5﹪w/v的trypsin即0.2﹪w/v的EDTA液, 所有的培养液, 在使用前, 必须先抽出少量, 先在CO2恆温培养相中培养至少2天, 无污染出现, 才能使用. 在从事基因植入动物细胞技术前, 应先熟悉动物组织培养, 即生长曲线为必要之练习. 每4小时, 由12圆隔培养盘中, 取出一隔之细胞计数, 至72小时为止. 藉此练习来熟悉无菌即培养技术.
以Calcium Phosphate沉淀DNA于HEPES缓冲液中并使DNA植入动物细胞法：
材 料：
生长期Hela细胞
培养液
质体DNA(含能在动物细胞中表现之可探测基因)(每次转植需10~50μg DNA)
2.5M CaCl2
2x HEPES-buffered saline (Hebs)
[配方]16.4g NaCl
11.9g HEPES acid
0.21g Na2HPO4
800ml dH2O
以5N NaOH调整pH至7.05
以0.45μm滤膜过滤消毒, 分别用50ml量保存在-20℃
注意：此时必须将0.5ml之2xHeBS与0.5ml之250mM CaCl2溷合, 看有否沉淀发生, 如无很细的沉淀, 则效果不佳.
Phosphate-buffered saline (PBS)
[配方] 10X保存液配方：
80g NaCl
2g KCl
11.5g Na2HPO4 7H2O
2g KH2PO4
1X的使用液配方： (pH约为7.3)
137mM NaCl
2.7mM KCl
4.3mM Na2HPO4 7H2O
1.4mM KH2PO4
37℃, 5﹪CO2恆温培养箱
10cm组织培养皿
15ml无菌conical tube
方 法：
1. 在转植前一日, 将细胞接种入培养皿, 约1：15比率稀释完全满佈的细胞, 加入9ml培养液.
2. 将要转值得DNA, 以酒精沉淀, 并晾乾, 再溶入450μl的无菌蒸馏水中, 再加入50μl之2.5M CaCl2. (此处以酒精沉淀DNA的目的在消毒)
3. 在一个15ml的conical tube中加入500μl的2X HeBS, 此时一面以一个无菌1μl吸管向此液中打气, 一面一滴滴的加入DNA/CaCl液, 加完后立即votex 5秒钟.
4. 置室温20min.
5. 将此DNA沉淀液均匀分布在组织培养皿之细胞上.
6. 培养6小时, 倒去培养液, 以5ml之1X PBS洗细胞2次, 再加入10ml培养液.
7. 若为暂时性的转植, 隔日即可取下检测. 若为培养稳定之转植细胞, 则令细胞长二次分裂的时间, 在保存之.
预期结果：约10﹪的细胞可被转植.
附注：
为能侦测基因有否植入细胞, "可探测基因"如β-galactosidase, 或萤火虫之luciferase基因均可使用.
在此之前, 本手册层介绍将基因转植入细菌的方法, 当时所使用的为快速简易法, 但基因植入的成功率极低, 此外也已介绍CaCl2法, 在此一并将使用CaCl2来转植细菌的方法列出, 供参考：
材 料：
LB培养液
E.Coli纯菌
CaCl2液
[配方]60mM CaCl2
15﹪glyerol
10mM PIPES, pH7.0 (如无PIPES, 则取上二种材料配製)
可高温高压消毒.
LB培养皿含ampicillin
Plasmid DNA
方 法：
1. 将此菌E.Coli接种于50ml LB液中, 过夜37℃, (250rpm)振盪培养.
2. 取上述E.Coli 4ml, 加入有400ml LB液之1 liter锥瓶, 37℃, 250rpm, 培养6小时.
3. 将(2)中的E.Coli分装在离心管中, 每支50ml, 并置冰上10min, 再离心5,000rpm, 5分钟, 4℃.
4. 将细菌沉淀再溶于10ml, CaCl2液中, 再于4℃, 5,000rpm, 5min.
5. 再将细菌沉淀溶于10ml CaCl2液中, 置冰上30min, 再4℃, 离心5,000rpm, 5min.
6. 再将E.Coli溶于2ml CaCl2液中, 再分成250μl至微量离管中. 并保存在-70℃, 待用.
7. 取一支圆底离心管, 置冰上,加入10至25μl之plasmis DNA约10ng, 取出冷冻于-70℃的细菌, 快速在37℃解冻, 取出100μl加入含DNA的离心管中. 置冰上, 10min.
8. 将此离心管转投入42℃水溶中, 2min, 加入1ml之LB液, 再放37℃, 250rpm, 1hr.
9. 将此转植过的细菌, 稀释数次, 每次以玻棒涂平盘法涂在恆温培养箱, 至第二日检视结果.