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新闻来源：未知 发布时间：2012-5-21 14:19:44　本站主页地址：http://www.jiance17.com

不同浓度的乙基雌性激素的酵母菌细胞增生测试

于15mL离心管中加入3 mL培养液(SD medium-His)，自培养皿上刮取少许酵母菌加入培养液中，混合均匀，至于orbital shaker上培养隔夜。

以绝对酒精配制100 ppb 及10 ppb乙基雌二醇。

取10 m L绝对酒精、10 ppb雌二醇20 m L、50 m L ，100 ppb乙基雌二醇10 m L、20 m L、50 m L至100 mL血清瓶中，各三重複，待酒精挥发至乾，加入2 mL SD-medium-His-Ura培养液。此试验雌二醇最终浓度为0.1、0.25、0.5、1.0、2.5 ppb。

取10 m L 绝对酒精至100 mL血清瓶中，各三重複，待酒精挥发至乾，加入10 mL SD-medium-His培养液。作为此次试验的正控制组。

以121 ℃、15分钟将上述培养液灭菌，待冷却至室温。

将前一日培养的酵母菌，移植至上述培养液，经16、24、40、48小时取100 m L进行细胞计数。

低浓度的乙基雌性激素的酵母菌细胞增生测试

于15mL离心管中加入3 mL培养液(SD medium-His)，自培养皿上刮取少许酵母菌加入培养液中，混合均匀，置于轨道震盪器上培养隔夜。

以绝对酒精配制乙基雌二醇，浓度为0、0.1、0.2、0.5、1.0、2.0、5.0、10.0、20.0、50、100、200、500 ppb，取10 m L加至100 mL血清瓶中，各三重複，待酒精挥发至乾，加入10 mL SD-medium-His-Ura培养液，使乙基雌二醇最终浓度为0、0.1、0.2、0.5、1.0、2.0、5.0、10.0、20.0、50、100、200、500 ppn。

取10 m L 绝对酒精至100 mL血清瓶中，各三重複，待酒精挥发至乾，加入10 mL SD-medium-His培养液。作为此次试验的正控制组。

以121大气压、15分钟将上述培养液灭菌，待冷却至室温。

将前一日培养的酵母菌，移植至上述培养液，经24小时取100 m L进行细胞计数。

四、结果

酵母菌细胞数之定量分析

将灭菌之培养液以分光光度计由波长360 nm至波长800 nm每隔20 nm读一次吸光值观察此培养液在此波长范围内有无特殊之吸光值，其结果如图一所示；培养PL3之酵母菌液的结果如图二所示。

由图一与图二所见，酵母菌的培养液在波长500 nm吸光值逐渐增加，而含有酵母菌之菌液随着波长减短而吸光值逐渐增加，波长500 nm至800 nm对酵母菌个数的推估应稳定而合适，John Wiley 建议以波长600 nm作为推估酵母菌细胞个数的固定波长。

在显微镜的观察下，酵母菌细胞为圆形颗粒，出芽生殖，常有许多细胞集结在一起，不易计数，在两种不同浓度菌液分别测其分光光度(OD600)，在分光光度计波长在600 nm下结果如表一所示。

酵母菌液细胞个数与分光光度计吸光值线性动态范围

将培养24小时的菌液连续稀释，以分光光度计波长600 nm 测其吸光值其结果如图三。

酵母菌生长曲线测试

酵母菌培养第3、7、22、30、48、54小时观察结果如图四所示。

酵母菌细胞在培养前7个小时以显微镜观察也不易看出有增长的现象，第22小时观察时乙基雌二醇与阳性控制组已有增生的现象，至30小时后酵母菌细胞浓度不再随时间增长而有生长的现象，阳性控制组一直增生至54小时，而雌二醇一直到第48小时才观测出细胞增生的现象。

酵母菌初始细胞数对细胞增生测试的影响

以96孔盘观测雌性激素对酵母菌增生情形如图五、六，以乙基雌二醇做测试，其在波长600 nm的吸光值，空白试验于低细胞浓度初始值如1000或10000 cell/ well下，吸光值并没有明显增加，但是酵母菌细胞数浓度在50000、100000 cell/ well，即使没有雌性激素，吸光值仍明显高于细胞数1000 cell/ well。细胞浓度1000 cell/well在乙基雌二醇浓度0.2 ppb时有明显吸光值，但是0.2至5 ppb吸光值无明显差异p<0.05。细胞浓度10000 cell/well在乙基雌二醇浓度0.05 ppb时有明显吸光值随着乙基雌二醇浓度增加吸光值明显增加，细胞浓度50000、100000 cell/well在乙基雌二醇浓度0.05 ppb时就有明显吸光值。

图六表示细胞初始浓对细胞增生试验的影响，以雌二醇为测试对象，细胞增生的数量比乙基雌二醇较少，初始细胞数为1000 cell/well时，除了在5 ppb略有增加，而其他浓度无增生的情形，初始细胞数过高，如5000 或100000 cell/well，均使空白组细胞有增生的现象，而初始细胞数10000 cell/well增生效果明显

不同浓度的乙基雌二醇对细胞增生试验

以不浓度的乙基雌二醇0、0.1、0.25、0.5、1、2.5 ppb及阳性控制组进行细胞增生试验，在第16、24、40、48小时进行观察，结果如图六所示。在第16小时增生还不明显，第24小时除空白组与1ppb乙基雌二醇外，均有增生的现象，随浓度增加，而增生量增加，但是24小时后随时间增加而有衰减的现象。

低浓度乙基雌二醇对酵母菌增生试验

降低乙基雌二醇浓度对酵母菌增生情形进行测试，浓度分别为0、0.1、0.2、0.5、1、2、5、10、20、50、100、500、500 ppn乙基雌二醇培养24小时，其结果如图七所示，一直到50 ppn才有反应，50至500ppn以分光光度计检测看不出有何差别。