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本文标题:"含有编码荧光蛋白DNA的质粒检测电子显微镜"

新闻来源:未知 发布时间:2017-3-13 1:06:44 本站主页地址:http://www.jiance17.com

含有编码荧光蛋白DNA的质粒检测电子显微镜

程是相似的。荧光蛋白嵌合体通常在N端或C端加入融合结构。2.
获取目的蛋白N端或C端结构一功能的知识将有助于避免干扰母体蛋
白的功能和/或
  定位。而且,了解每个末端表达定位的亚细胞环境对嵌合体的设
计将是有用的。例
  如,如果可能的话,避免把GFP加入到酸性蛋白水解环境中的蛋
白末端(如溶酶体
  内腔),如果没有相关知识,最初可制备N端和C端都连接GFP的嵌
合体。3a.末端插入连接子:如果N端和C端都包含决定目标蛋白功
能和定位的结构域,则
    在它和荧光蛋白之间插入短的连接肽以减少位阻的影响。3b.
包埋插入:也可以把荧光蛋白插入到分子的基本序列中,通常在未
结构化的环形
    区域内。如果其他方法失败可考虑此种方法,但不能保证成功
。4.某些情况下,把编码荧光蛋白的eDNA插入含有编码目标蛋白D
NA的质粒更容易。
  此时,根据目标蛋白是N端融合还是C端融合,应格外注意荧光蛋
白的5’端和
  3’端。5.如果产生的是N端融合(指GFP连接到目标蛋白的N端)
,贝Ⅱ必须合理设计GFP
  编码区域的两个末端。把Kozak序列和GFP翻译起始密码子结合起
来将会保证
  mRNA的高效翻译,同时应该删除GFP的终止密码子或者将其转化
成编码氨基酸。6.如果产生的是C端的融合,则删除目标蛋白的终
止密码,或者将其转化为一个编码
  氨基酸;保存GFP的终止密码子。7.另外也可以把编码目标蛋白
的cDNA插入到含有编码荧光蛋白DNA的质粒中。在
  很多情况下,这种方法更简单,因为许多可以表达荧光蛋白的质
粒可以买到。这些
  质粒通常包含一个巨细胞病毒(CMV)连接的早期启动子(在哺乳动
物细胞内高效
  表达),一个包含了许多独特的限制性核酸内切酶识别位点的多
克隆位点(MCS)
  (促进嵌合体的产生),一个可使质粒在细菌种选择性扩增的具抗
生素抗性的区域,
  通常包括G418筛选基因。与上面所描述的荧光蛋白的插入一样,
目标蛋白插入到
  这些质粒中也具有同样的限制。8.如果产生的是C端融合,则把
目标蛋白的eDNA插入到一个荧光蛋白编码序列的5’
  端含有MCS的质粒中。删除目标蛋白的终止密码子,或者将其转
化为一个编码氨基
  酸,插入一个含有目标蛋白翻译密码子的Kozak序列。9.如果产
生的是N端融合,则把目标蛋白的eDNA插入到一个荧光蛋白编码序
列3’端
  含有MCS的质粒中(荧光蛋白编码区的翻译起始段含有Kozak序列)
。删除荧光蛋
  白终止密码子,或者将其转化为一个编码氨基酸;保存目标蛋白
的终止密码子。

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