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本文标题:"实验步骤-免疫细胞化学染色法之单一染色"

新闻来源:未知 发布时间:2012-11-12 16:47:18 本站主页地址:http://www.jiance17.com

实验步骤-免疫细胞化学染色法之单一染色
免疫细胞化学染色法 ( immunocytochemistry)

单一染色
利用单一免疫细胞化学染色法(immumocytochemical staining)可鉴定本实验
培养之混合神经胶质细胞的型态、种类及组成比例。以 anti-glial fibrillary acidic
protein(anti-GFAP)辨示星状胶质细胞(asatrocytes),由于星状胶质细胞含有丰
富的 glial fibrillary acidic protein 故被染上的星状胶质细胞,在显微镜下可看到一
丝一丝的 glial fibrillary acidic protein。而用于辨示微小胶质细胞(microglia)的有
anti-ED1、anti-OX6、anti-OX42;anti-ED1 可辨示微小胶细胞细胞质内的溶小体
(lysosome)一般而言,anti-ED1 可标示的是活化态的微小胶质细胞,但离体实
验(in vitro)对微小胶质细胞而言,就会稍微使得微小胶质细胞被活化但其活化
的程度与给 LPS 处理后相较仍有程度上之差异;从 anti-ED1 染色可看到给予 LPS
处理的微小胶质细胞其外形变得比较圆、几乎看不到突起的触角(process)而无
给予 LPS 处理的微小胶质细胞亦可被标示到,但显微镜下可看到其外形较细长、
仍可清楚看到突起的触角。anti-OX6 辨示活化状态之微小胶细胞细胞膜上 MHC
class II 的接受器。而 anti-OX42 可辨示微小胶质细胞细胞膜上 CR III 接受器,不
论微小胶质细胞是否被活化都可被 anti-OX42 标示到。当微小胶质细胞被活化
时,其型态会由静止状态(resting stage)变成活化状态(activated stage),即细胞
的外观会由不规则的、细长的外形且可看到突起的触角慢慢转变为外形较圆、突
起的触角逐渐缩短的型态,称为(amoeboid)

实验步骤
1. 将细胞种于置有玻片的 24 孔培养盘中,定期更换新鲜培养液至可实验状态。
药物处理后的细胞以 PBS(1X、pH=7.4)清洗二次(10 分钟 / 次)后,加
入 4% paraformaldehyde 置于室温下二十分钟以固定细胞,之后移除

paraformaldehyde 再以 0.05M TBS(pH=7.6)清洗细胞。
2. 加入 3% H2O2 于 0.05M TBS,置室温下作用三十分钟以去除内生性过氧化酵素
(endogenous peroxidase)。
3. 以 0.05M TBS 清洗细胞三次,移除 H2O2,尽可能避免泡泡产生。
4. 去除非特异性的结合(nonspecific binding),将 10% normal horse serum(NHS)
或 normal goat serum(NGS),0.1% Triton X-100 加至 0.05M TBS 混合后,加入
24 孔培养盘中使之足以覆盖表面,置室温下一小时。
5. 移除 NHS 或 NGS,以 0.05M TBS 清洗细胞三次后,加入初级抗体置于 4℃过
夜反应。
6. 移除初级抗体,以 0.05M TBS 清洗细胞三次后,加入次级抗体于室温下反应
一小时。
7. 移除次级抗体,以 0.05M TBS 清洗细胞三次后,加入 peroxidase-conjugated
streptavidin 于室温下反应三十分钟。
8. 移除 peroxidase-conjugated streptavidin,以 0.05M TBS 清洗细胞三次后,加入
DAB(5% DAB+1% H2O2)作呈色反应

9. 对比染色

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